1999年，科學(xué)家在最簡(jiǎn)單的真核生物釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了具有延長(zhǎng)壽命的Sir2基因。此后，在小鼠等嚙齒類動(dòng)物中，Sir2的同源基因SIRT6同樣被發(fā)現(xiàn)有此魔力。自此，SIRT6被科學(xué)界奉為經(jīng)典的“長(zhǎng)壽基因”，成為人類掌控衰老速度的一個(gè)熱門突破口。
北京時(shí)間8月23日凌晨，中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與再生創(chuàng)新研究院等研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《自然》(Nature)刊發(fā)歷時(shí)3年的一項(xiàng)最新的合作研究成果：首次實(shí)現(xiàn)SIRT6在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長(zhǎng)壽基因敲除的食蟹猴模型。
非人靈長(zhǎng)類作為人類的“表親”，在基礎(chǔ)科研和醫(yī)學(xué)研究中具有其他模式生物無可比擬的優(yōu)勢(shì)。國(guó)家杰出青年基金獲得者、干細(xì)胞國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃首席科學(xué)家、中科院生物物理所研究員劉光慧是該項(xiàng)成果的通訊作者之一，他在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)采訪時(shí)表示，“關(guān)于SIRT6這個(gè)長(zhǎng)壽基因在包括人在內(nèi)的靈長(zhǎng)類中所起的作用，例如是否可以調(diào)節(jié)衰老，此前由于研究手段的限制使得人們無法回答這個(gè)問題。”
有趣的是，這項(xiàng)初衷為解析長(zhǎng)壽基因如何調(diào)節(jié)食蟹猴衰老的研究，最終卻顛覆了此前對(duì)長(zhǎng)壽基因的傳統(tǒng)認(rèn)知。一直致力于通過研究人類加速衰老疾病的機(jī)制來解決諸多老齡化問題的劉光慧等人，這次的注意力從生命終端被拉到了生命的起點(diǎn)：經(jīng)典“長(zhǎng)壽基因”的缺失居然導(dǎo)致食蟹猴在子宮內(nèi)發(fā)育不良并出現(xiàn)出生后早夭。
首次在非人靈長(zhǎng)類猴子身上得到的這一結(jié)論，讓劉光慧等格外興奮。“此前在嚙齒類等動(dòng)物中看到的一些“加速衰老的癥狀”可能并不完全是“衰老”的表型;根據(jù)基于食蟹猴的研究結(jié)果，SIRT6在胚胎發(fā)育早期的缺失可能更多的是延遲了機(jī)體的發(fā)育。SIRT6缺乏小鼠可能也具有發(fā)育遲緩的表型，但可能由于嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有較大的種屬差異，例如，小鼠具有更長(zhǎng)的端粒等，所以SIRT6敲除的小鼠可以在出生后存活4周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。”
值得注意的是，SIRT6導(dǎo)致食蟹猴子宮內(nèi)發(fā)育遲緩這一點(diǎn)，目前在人類中也有了蛛絲馬跡。
就在劉光慧等人的論文發(fā)表前不久，美國(guó)有研究團(tuán)隊(duì)在《基因與發(fā)育》(Genes & Development)發(fā)文，該研究團(tuán)隊(duì)通過篩查流產(chǎn)胎兒發(fā)現(xiàn)，在人類SIRT6基因上的功能突變也會(huì)引起胎兒子宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。
劉光慧表示，“這實(shí)際上同我們?cè)诤镒由砩峡吹浇Y(jié)果非常類似，很好地佐證了我們的結(jié)論。” SIRT6敲除猴子模型或可以為人類圍產(chǎn)期致死綜合征的發(fā)病機(jī)理提供新的研究途徑。
除劉光慧之外，該研究的通訊作者還包括中科院動(dòng)物研究所李偉研究員和胡寶洋研究員。中科院生物物理研究所張維綺研究員，中科院動(dòng)物研究所萬海峰助理研究員、馮桂海副研究員和曲靜研究員為共同第一作者。中國(guó)干細(xì)胞與生殖研究領(lǐng)域權(quán)威、中科院動(dòng)物研究所研究員、中科院院士周琪也參與并指導(dǎo)了此項(xiàng)研究。
讓食蟹猴喪失長(zhǎng)壽基因
Sirtuin蛋白家族本質(zhì)上是一類從酵母到人類高度保守的去乙?；?，其備受關(guān)注源于和人類孜孜以求的長(zhǎng)壽扯上了關(guān)系。
除釀酒酵母之外，線蟲、果蠅，直至到更高等一點(diǎn)的小鼠，科學(xué)家均發(fā)現(xiàn)有Sir2的同源基因存在。而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞里，目前已知的Sir2同源基因有7個(gè)，即SIRT1至SIRT7。
相信紅酒有助長(zhǎng)壽的人或許對(duì)SIRT1并不陌生。有研究者認(rèn)為，紅酒中包含的白藜蘆醇(Reseratrol)能夠通過激活SIRT1來使得哺乳動(dòng)物壽命延長(zhǎng)。2008年，英國(guó)制藥巨頭葛蘭素史克(GSK)還付出7億多美元購(gòu)得SIRT1藥物開發(fā)的一項(xiàng)技術(shù)。盡管如此，白藜蘆醇的作用機(jī)制和療效在科學(xué)界還存在著一定的爭(zhēng)議。
相比于SIRT1，人們認(rèn)為SIRT6在衰老和壽命調(diào)控中同樣具有重要的作用。SIRT6敲除小鼠壽命會(huì)縮短，表現(xiàn)出加速衰老的特點(diǎn)，例如皮下脂肪缺失，脊柱彎曲、骨量減少、端?？s短等。人們相信，SIRT6對(duì)于哺乳動(dòng)物來說是一個(gè)經(jīng)典的‘長(zhǎng)壽蛋白”，具有調(diào)控機(jī)體衰老的作用。
劉光慧表示，“目前人們廣泛應(yīng)用的SIRT6敲除小鼠早衰模型具有重要的科學(xué)價(jià)值，不僅可以用于研究嚙齒類動(dòng)物衰老的規(guī)律，而且人們可以利用這個(gè)模型進(jìn)行藥物篩選和評(píng)價(jià)。具有延長(zhǎng)早衰小鼠壽命活性的化合物可能對(duì)于人類衰老性疾病的防治具有提示和借鑒意義。”
然而，受限于基因編輯技術(shù)等原因，SIRT6這一重要的調(diào)控衰老的開關(guān)此前從未在猴子或人類身上被科學(xué)家隨意開啟或關(guān)閉。此前在2016年，劉光慧團(tuán)隊(duì)僅在人類間充質(zhì)干細(xì)胞中通過基因編輯敲除SIRT6，并觀察到SIRT6的缺失確實(shí)能夠?qū)е氯烁杉?xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡。
“高效、徹底地在猴子體內(nèi)敲除特定基因的技術(shù)難度非常大，迄今為止還沒有敲除任何衰老和長(zhǎng)壽基因的報(bào)道。”論文共同通訊作者李偉研究員提到，“需要在胚胎發(fā)育早期運(yùn)用非常高效的CRISPR技術(shù)，這樣才能干凈地敲掉SIRT6基因，使之后產(chǎn)生的機(jī)體的所有細(xì)胞都不再有這個(gè)基因。”
基因敲除食蟹猴產(chǎn)生示意圖。
而在此番研究中，李偉和劉光慧等人借助高效CRISPR–Cas9基因編輯技術(shù)最終成功獲得SIRT6全身敲除的食蟹猴。
研究團(tuán)隊(duì)共制備98個(gè)食蟹猴受精卵， 其中48個(gè)發(fā)育、形態(tài)學(xué)正常的基因敲除胚胎被移植到12只代孕猴子中。有4只代孕猴子受孕成功，其中3只完成了大約165天的懷孕周期，每只均生下一只小母猴。另一只在懷孕中期流產(chǎn)了一只公猴。
“早產(chǎn)兒”僅存活數(shù)小時(shí)
按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，研究團(tuán)隊(duì)將會(huì)花上比在小鼠等模式動(dòng)物身上多得多的時(shí)間來觀察食蟹猴的“早衰”。畢竟，如果一只猴子的壽命能達(dá)到20余年，樂觀一點(diǎn)的話，研究團(tuán)隊(duì)希望在猴子出生后的1年至數(shù)年后能觀察到加速衰老的跡象。
不過，這些實(shí)驗(yàn)預(yù)期在SIRT6基因敲除食蟹猴出生后的數(shù)小時(shí)后即被完全打破節(jié)奏。
論文中提到，SIRT6敲除猴子出生時(shí)明顯偏小，體重比野生型新生猴子約輕3.5倍，相當(dāng)于這些野生型新生猴子在2-4個(gè)月胎齡時(shí)的大小。
“壽命只有幾個(gè)小時(shí)，這些剛出生的SIRT6敲除的猴子非常小，發(fā)育速度幾乎減慢了一倍，但它們還是足月生產(chǎn)出來了。這些“早產(chǎn)”的猴子在出生后是不能很好存活的，各器官組織都遠(yuǎn)沒有達(dá)到可以在母體外存活的成熟度。”李偉表示。
也就是說，SIRT6敲除導(dǎo)致食蟹猴在子宮內(nèi)出現(xiàn)了全身發(fā)育遲緩，導(dǎo)致類似“早產(chǎn)”而無法在出生后生存。
出生大小、體重差異比較。
論文共同通訊作者胡寶洋提到，“我們檢測(cè)了SIRT6敲除的所有食蟹猴，在基因組和表觀基因組水平都沒有發(fā)現(xiàn)任何“加速衰老”的特征，相反看到了更加不成熟的發(fā)育早期狀態(tài)。而皮下脂肪減少，骨密度減少，腸上皮受損等在SIRT6敲除小鼠中被認(rèn)為是加速衰老的特征，我們?cè)赟IRT6敲除食蟹猴身上同樣也看到了。不過，2-4個(gè)月胎齡的野生型猴子也具有類似的表型，說明這些未必是衰老的特征。”
胡寶洋認(rèn)為，或許科學(xué)家們?cè)谛∈笊砩峡吹降南嚓P(guān)異常并不完全是加速衰老， SIRT6在食蟹猴中的缺失阻滯了器官的發(fā)育，發(fā)育的時(shí)鐘被撥回到胎兒期的特定階段。“我們?cè)诤镒永镉^察到的許多現(xiàn)象與小鼠都不太一致。”
此外，同新生的野生型猴子相比，SIRT6敲除食蟹猴的腦更小，大腦和小腦半球的皮質(zhì)層更薄，類似于野生型猴的胎兒。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，基于這些數(shù)據(jù)，SIRT6可能是食蟹猴腦發(fā)育過程中神經(jīng)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控開關(guān)，SIRT6的缺失會(huì)推遲神經(jīng)元的成熟。
研究團(tuán)隊(duì)隨后在分子機(jī)制層面解釋已有的結(jié)論。他們比較了SIRT6敲除食蟹猴和野生型新生猴子7種器官中全基因組RNA的表達(dá)，鑒定出至少在一種器官中，兩者存在著多達(dá)11001個(gè)基因表達(dá)的差異。其中在至少四種器官中，有1026個(gè)基因表達(dá)存在差異。
而在所有存在表達(dá)量差異的基因中，長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸 H19(最早被鑒定出的印跡基因之一，印記基因被認(rèn)為與發(fā)育和很多疾病相關(guān))上調(diào)最為明顯，在SIRT6敲除食蟹猴腦部的表達(dá)量是野生型新生猴子的27.5倍。
而此前有研究已經(jīng)得出結(jié)論，H19表達(dá)在胚胎發(fā)育過程中對(duì)包括大腦在內(nèi)的各組織發(fā)育具有非常關(guān)鍵的作用。
在人類中會(huì)如何？
在猴模型中，敲除經(jīng)典“長(zhǎng)壽基因”SIRT6帶來了顛覆性的新認(rèn)知，那如果進(jìn)一步延伸到人類，結(jié)果又會(huì)如何?人類的“表親”是否幫助準(zhǔn)確預(yù)演了結(jié)果?
在研究衰老調(diào)控的同時(shí)長(zhǎng)期研究干細(xì)胞的劉光慧想到的是對(duì)人類干細(xì)胞“動(dòng)刀”。研究團(tuán)隊(duì)采用TALEN基因編輯技術(shù)獲得SIRT6敲除的人類胚胎干細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)而將這種萬能的“種子細(xì)胞”誘導(dǎo)分化成神經(jīng)前體細(xì)胞。
“我們利用現(xiàn)有的成熟的研究平臺(tái)，可以通過對(duì)人的干細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，進(jìn)而研究定蛋白對(duì)人類干細(xì)胞或終末分化細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響。”劉光慧提到，和眾多致力于建立非人靈長(zhǎng)類疾病模型的團(tuán)隊(duì)不同，他們更關(guān)注于將食蟹猴研究中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)規(guī)律在人類干細(xì)胞中體系加以深入進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。
研究團(tuán)隊(duì)在人類神經(jīng)干細(xì)胞中得到了和在SIRT6敲除食蟹猴腦中類似的結(jié)論。SIRT6敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)元分化的延遲，研究人員未能在顯微鏡下看到成片連接的特征性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SIRT6敲除的人類神經(jīng)細(xì)胞中也具有較高的H19轉(zhuǎn)錄本水平。
人類干細(xì)胞神經(jīng)分化比較。
接下來的問題是，如果要疏通所謂的“通路”，研究團(tuán)隊(duì)必須還要回答SIRT6是否直接控制H19表達(dá)?研究團(tuán)隊(duì)最終發(fā)現(xiàn)，受SIRT6調(diào)控的乙?；M蛋白H3K56ac(組蛋白H3第56位賴氨酸殘基乙?；揎?在其中是中間一環(huán)。
正常情況下，SIRT6能結(jié)合到H19上游的印記調(diào)控區(qū)，SIRT6作為一種組蛋白去乙酰化酶可以使得組蛋白去乙?；?，從而導(dǎo)致H19轉(zhuǎn)錄沉默。由此在神經(jīng)分化的過程中，H19轉(zhuǎn)錄水平并不會(huì)特別高，神經(jīng)分化程序保持正常。
研究團(tuán)隊(duì)稱，這也就意味著，SIRT6可以通過介導(dǎo)H19印記調(diào)控區(qū)的組蛋白去乙酰化來反式抑制H19的表達(dá)。
然而，在 SIRT6敲除的人類神經(jīng)前體細(xì)胞模型中，看到的一個(gè)結(jié)果就是SIRT6的缺乏使得H3K56ac增多，同時(shí)還伴隨有更多的H19轉(zhuǎn)錄的反式激活因子CTCF。這些因素都導(dǎo)致H19升高，從而抑制神經(jīng)分化。
實(shí)際上，在SIRT6敲除食蟹猴中同樣觀察到，H3K56ac在多種組織中均增加。和上述結(jié)論一致的是，SIRT6敲除食蟹猴中H19的表達(dá)因此而大幅增加。
SIRT6-H3K56ac-H19通路。
SIRT6-H3K56ac-H19這條通路在實(shí)驗(yàn)室條件下的人類干細(xì)胞模型中被拼接完整。而在人體中，這條通路實(shí)際上也在若隱若現(xiàn)。
此前有研究證明，H19在人體中過量表達(dá)被證明和銀羅素綜合征(SRS)相關(guān)。銀羅素綜合征又稱先天侏儒癥，發(fā)病率只有十萬分之一，它的特點(diǎn)即是嚴(yán)重的子宮內(nèi)和出生后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。
同樣有力的一點(diǎn)是，2018年3月，《基因與發(fā)育》發(fā)表美國(guó)科研團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)成果顯示，人類中SIRT6的功能突變(D63H)會(huì)引起胎兒子宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。
劉光慧表示，“該研究團(tuán)隊(duì)主要通過篩查流產(chǎn)的胎兒，發(fā)現(xiàn)有某些胎兒攜帶有SIRT6單點(diǎn)突變，而突變位點(diǎn)剛好是去乙?；傅幕钚晕稽c(diǎn)，他們看到的包括神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩等表型，實(shí)際上跟我們?cè)谑承泛镏锌吹降暮茴愃?，非常好地佐證了我們的發(fā)現(xiàn)。”
劉光慧認(rèn)為，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)全新的人類出生前發(fā)育遲緩(圍產(chǎn)期致死)綜合征的研究體系。“SIRT6作為表觀遺傳因子可以調(diào)節(jié)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的出生前發(fā)育，而在臨床上，我們的發(fā)現(xiàn)有助于深入理解因子宮內(nèi)發(fā)育遲緩而導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)或新生兒死亡的分子基礎(chǔ)。接下來更為重要的科學(xué)問題是，在臨床上有多少胎兒發(fā)育遲緩的病例與SIRT6基因的突變有關(guān)，我們?nèi)绾伟l(fā)展有效的生物醫(yī)學(xué)手段進(jìn)行干預(yù)和治療?”
